细胞活性检测是生命科学研究的基石，而ATP作为细胞代谢的“能量货币”，其浓度直接反映细胞状态。ATP是细胞活力的标志，因为它存在于所有代谢活性的细胞中，因此，ATP的数量与培养中活细胞的数量成正比。如果细胞数量因增殖而增加，那么ATP的数量就会增加；如果细胞数量因细胞死亡而减少，则ATP的数量就会减少。ATP检测发光法是比色法、荧光法和放射性同位素法的一种替代方法，可用于定量评价培养的哺乳动物细胞的增殖和细胞毒性。
检测原理
从裂解细胞中释放的ATP在分子氧的存在下与底物、萤火虫萤光素酶和Mg2+反应，促使发光，反应原理如下所示。若细胞死亡，ATP生成量减少，发光量也相应减少。通过测量活细胞中的ATP，可评估细胞数量的增减。然后使用酶标仪luminescence模块对发射的光进行量化，由此测量的发光信号与样品中ATP的数量成正比。
ATP生物发光方法
ATPlite™1step2.0 Assay产品介绍
瑞孚迪ATPlite™1step2.0 Assay是用于定量检测细胞活性的高灵敏、均质性的ATP一步法检测系统。利用萤火虫荧光素酶检测ATP，进而检测哺乳动物细胞的增殖和细胞毒性，仅需加入细胞裂解液和底物溶液就可进行检测，比传统的 MTT/SRB 法更为方便和精确。
瑞孚迪ATPlite™1step2.0 Assay特点与优势:
①即用型检测试剂，将等体积的试剂直接加入到细胞培养物中,即可进行检测，真正的“一步法”操作
②可产生稳定的“辉光型”发光信号，半衰期大于2小时；
③不含硫醇类化合物，无毒无异味；
④含有耐热萤光素酶和特殊稳定成分，在4℃保存45天或室温保存5天后其光输出会始终保持在85%以上，避免了分装或反复冻融，提高了操作的便捷性。
96孔（384孔)微孔板的操作步骤如下：
a. 在室温下平衡试剂,可用设置20-22℃的水浴装置进行平衡。
b. 颠倒内容物轻轻混匀，以获得均质溶液。
c. 对于96孔 (384孔)微孔板,每孔添加100uL (25μL)本试剂到含有100μL(25uL)的细胞培养物中。
d. 如果需要,应准备含无细胞培养基的对照孔,以测定本底发光。
e. 使用微孔板振荡器,以700 (1100)rpm振荡96孔(384孔)板2分钟。
f. 将培养板在室温孵育5分钟,以稳定发光信号,检测微孔板发光值。
如有需要,暗孵育白色微孔板10分钟,以减少微孔板的磷光现象。黑色微孔板的磷光非常小,可以不需要暗孵育。
关键注意事项：
1.提升信号强度：
培养基：酚红等有色物质会吸光，建议检测前更换为无酚红培养基或DPBS。
温度：试剂与微孔板的最佳操作温度为22℃。检测前，先将细胞板从培养箱取出，平衡至室温。
2.微孔板选择（建议根据发光酶标仪选择）
白色板：信号强，但高ATP浓度时易使检测器饱和。
黑色板：可有效避免信号饱和，背景磷光低，通常无需暗孵育。
3.操作环境：柔和光线下操作，避免阳光或强荧光灯直射，以防微孔板产生磷光，抬高本底。
4.批量检测技巧：若平衡了多瓶试剂，在添加到微孔板前，建议将其混合均匀，以确保孔间一致性
ATP标准曲线制作操作步骤：
a. 在需要定量细胞释放ATP的数量时,可选择制作ATP标准曲线,推荐使用ATP二钠盐(品牌:Sigma;产品货号:A7699),用超纯水配置10mM的ATP标准液母液。
b. 标准曲线和样品需在同一块微孔板上。
c. 取ATP标准液母液,在培养基中制备2.5μM的ATP。
d. 在培养基中制备4倍连续稀释的ATP (2.5μM-9.5 nM)
e. 用移液器将试剂加入微孔板中,96孔板加入100μL,384孔板加入25μL。
f. 用震荡器将孔中的内容物混合2分钟。
g. 将微孔板放置室温孵育5分钟，以稳定发光信号，检测微孔板发光值。
标准曲线是将发光信号值转换为实际ATP浓度的关键标尺，能有效评估细胞特定处理下的ATP释放量。
ATP标准品检测：在培养基（MEM）中制备四倍连续稀释的ATP（2.5μM-9.5nM）溶液，将100μL含ATP标准品的培养基与100μL本试剂混匀，孵育10分钟读数。ATPlite 1step 2.0 信号值比ATPlite 1step高出三倍左右。
应用场景推荐：
1. 细胞毒性药筛：如Paclitaxel处理HELA细胞72小时后，试剂清晰区分存活与凋亡细胞
2. 长期稳定性实验：需多次取样的研究（如细胞周期监测）
3. 抗癌药物筛选：测试药物对肿瘤细胞的杀伤效果。
4. 毒性评估：环保领域检测污染物对细胞的损害。
5. 疫苗开发：验证疫苗是否有效激活免疫细胞。
6. 3D细胞模型：类器官或肿瘤球等复杂结构的活力监测
7. 临床医学：在一些疾病的诊断和治疗监测中发挥作用，如检测血液、体液等样本中的ATP含量，辅助判断感染、炎症等疾病的发生和发展
总结
在细胞活性检测的六大常用方法中，瑞孚迪ATPlite 1step 2.0 Assay以“一步法”设计兼顾稳定性与灵敏度，为细胞研究提供更可靠的量化工具，在药物筛选、毒性评估等多元场景中展现出的便捷性、稳定性与高灵敏度，能显著提升实验效率与数据可靠性。
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