你知道吗？我们身体里藏着一支“信号通信队”：G蛋白偶联受体（GPCR），它们趴在细胞膜上，像哨兵一样接收激素、神经递质等信号，再通过细胞内的“传令兵”把指令传递到深处，调控着心跳、血糖、情绪等几乎所有生理过程。而在这支“通信队”里，有个关键“传令兵”叫环腺苷单磷酸（cAMP），它的浓度变化直接反映GPCR的工作状态，是判断药物是否有效的核心依据。 当前，对细胞内 cAMP 动态变化的精准检测是 GPCR 信号通路研究与药物研发的关键环节，而均相时间分辨荧光（HTRF）技术是实现该检测需求的核心技术手段。小编在这里系统阐述 HTRF 技术的检测原理与应用逻辑，分析其在 GPCR 药物研发中的技术价值与实践作用。
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先搞懂：什么是 GPCR？
GPCR，全称“G 蛋白偶联受体”（G protein-coupled receptors），是存在于人体细胞表面的一类膜蛋白，就像细胞的“信号通信队”，能识别并结合体内的各类信号分子（比如激素、神经递质、脂质等），再通过与细胞内的G蛋白结合，将信号传递到细胞内部，进而调控生长、代谢、神经传递等关键生理过程。
从数量上看，GPCR 是人体最大的膜蛋白家族，约有 800 个成员[1]。不过其中近一半（约 400 个）是嗅觉受体，主要负责感知气味，不在药物研发的核心关注范围内；我们常说的 “药物研发相关 GPCR”，主要指剩下的400个左右“非嗅觉 GPCR”，它们广泛参与心血管、神经、代谢等系统的功能调节，也是疾病发生的重要“导火索”： 比如高血压、抑郁症、糖尿病等疾病，都可能与GPCR功能异常有关。
根据进化关系和结合的信号分子（配体）差异，GPCR 还能分成不同“家族”，配体种类从简单的离子、小分子（如shen上腺素），到复杂的肽类（如胰高血糖素样肽 GLP-1）、蛋白质都有，这种多样性也让它成为能覆盖多种疾病的“wan能靶点”基础。GPCR药物研发，就是针对这些关键的“通信兵”开发药物，通过调节它们的功能来治疗疾病的科学探索过程。
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为什么cAMP是GPCR研发的“关键信号”？
G蛋白偶联受体（GPCR）是极其重要的药物靶点家族，而环磷腺苷（cAMP）作为GPCR下游最关键的第二信使之一，其浓度变化直接反映了受体的激活状态。
GPCR接到外界信号后，会“召唤”细胞内的G蛋白帮忙。G蛋白家族里有两个关键成员：Gαs和Gαi。它们对cAMP的影响完全相反：
当GPCR与Gαs结合，会激活一种叫“腺苷酸环化酶（AC）”的物质，AC就像个“加工厂”，能把ATP（细胞能量货币）转化成cAMP，让细胞内cAMP浓度升高；
要是GPCR结合的是Gαi，就会抑制AC的活性，“加工厂”停工，cAMP浓度自然下降。
而cAMP浓度的高或低，又会进一步调控离子通道、蛋白激酶A（PKA）等“下游执行者”，最终影响细胞功能。比如，调节血糖的GLP-1受体被激活后，cAMP升高会促进胰岛素分泌；治疗高血压的β受体被抑制时，cAMP降低能减缓心跳。
所以，精准测量cAMP浓度，就像给GPCR装了个“信号仪表盘”：药物是否能激活/抑制目标GPCR、效果有多强，看cAMP的变化就知道。
Gαs（激活）、Gαi（抑制）对cAMP水平的调控
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HTRF技术：如何做到“精准捕捉”cAMP？
传统cAMP检测方法存在明显局限：ELISA操作繁琐需反复洗涤，LC-MS/MS设备成本高，BRET需对细胞进行基因改造，均难以满足药物研发中高通量、高灵敏的检测需求。而均相时间分辨荧光（HTRF）技术凭借独特优势，成为当前cAMP检测的优选方案，不同检测方法对比见下表：
HTRF技术基于竞争性结合原理实现 cAMP 精准定量：细胞产生的天然cAMP与d2红色染料标记的CAMP ，竞争性地与穴状化合物Eu标记的抗 cAMP抗体结合。当d2红色染料标记的cAMP与Eu标记的抗cAMP抗体结合时,体系中会产生较高的 HTRF 信号，而无标记 cAMP 与 Eu 标记的抗cAMP抗体结合，则不会产生HTRF 信号。因此，特异性HTRF信号与样品中天然cAMP的浓度成反比。细胞中普遍存在的磷酸二酯酶（PDEs）具有水解胞内cAMP的功能，为了防止PDEs作用下cAMP降解为AMP，建议实验中使用PDEs 泛抑制剂 (IBMX)以确保适当的cAMP积累及其后续检测。
它的核心原理很巧妙，靠的是一场“竞争性结合”
1. 准备“检测搭档”：一边是用穴状化合物（Eu Cryptate）标记的“抗cAMP抗体”，另一边是用d2红色荧光染料标记的“cAMP（cAMP-d2）”。这对“搭档”一旦结合，就会通过荧光能量共振转移（FRET）产生特定的HTRF信号。
2. 细胞“释放”cAMP：当我们用药物刺激细胞后，细胞内会产生天然cAMP。把细胞裂解后，这些内源性的天然cAMP就会和“cAMP-d2”一起，竞争结合Eu标记的抗体。
3. 信号解读“浓度”：样本中天然cAMP越多，“cAMP-d2”能结合抗体的机会就越少，产生的HTRF信号就越弱；反之，天然cAMP越少，信号越强。简单说，HTRF信号和cAMP浓度成反比，通过信号强弱就能算出cAMP的准确浓度。
这里还有个小细节：细胞里有一种叫“磷酸二酯酶（PDEs）”的物质，会把cAMP分解成AMP，影响检测结果。所以实验中通常会加一种叫IBMX的“PDEs抑制剂”，相当于给cAMP“保驾护航”，确保它能稳定积累，让检测更准确。
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选对试剂盒：不同GPCR，要“对症下药”
不是所有GPCR对cAMP的影响都一样，有的让cAMP大幅升高（比如Gαs偶联受体），有的让cAMP小幅降低（比如Gαi偶联受体）。如果用同一种试剂盒检测，很可能“捕捉不到”细微变化，或者超出检测范围。
Revvity提供了三种cAMP检测试剂盒，可更好地满足用户在定量响应不同类型 Gα亚基激活的 cAMP 积累时的需求。
举个例子：研发治疗糖尿病的GLP-1受体激动剂时，GLP-1受体是Gαs偶联型，激活后cAMP会大幅升高，这时选“cAMP-Gs HiRange Kit”就能准确覆盖高浓度范围；而研究某些抑制性GPCR（如治疗失眠的GABA受体）时，cAMP变化幅度小，“cAMP-Gi Kit”的高灵敏度就能派上用场。
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实验优化：这4步，让数据更可靠
有了好技术和试剂盒，实验操作的优化也很关键。分享几个核心优化步骤，帮你避开“坑”：
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选对细胞培养方式：贴壁还是悬浮？
贴壁培养：更贴近细胞在体内的生理状态，适合研究对细胞形态敏感的受体
悬浮培养：步骤更快速灵活，适合高通量筛选。
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做准标准曲线：确定检测“黄金范围”
标准曲线是计算cAMP浓度的“标尺”，必须做好这几点：
用实验对应的刺激缓冲液稀释cAMP标准品，避免环境差异影响结果；
通过Graphpad Prism拟合曲线，找到“IC10”和“IC90”，只有样本的HTRF信号落在这两个值之间，才能准确回算cAMP浓度。
03
优化细胞密度：不多不少才刚好
细胞太少：产生的cAMP不足，信号太弱；
细胞太多：可能挤压检测窗口，导致信号饱和。
建议用完全激动剂（比如检测Gαs受体时用Forskolin）测试不同密度，找到“检测窗口最大、信号落在标准曲线范围内”的密度。
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定好刺激时间和IBMX浓度
刺激时间：不同激动剂与受体结合的速度不同，比如异丙shen上腺素刺激β2受体时，15分钟后信号就会达到平衡，之后保持稳定，所以15-120分钟是最佳检测窗口。
IBMX浓度：一般加0.5mM就能抑制大部分PDEs活性，特殊细胞类型可适当调整。
HTRF技术，让GPCR研发更“高效精准”
凭借对 cAMP 的精准检测能力、适配不同 GPCR 的试剂盒体系及完善的实验优化方案，HTRF 技术既能快速捕捉 cAMP 细微变化，又能满足高通量筛选需求，为 GPCR 药物研发节省时间与成本。随着孤儿受体、多靶点联合等 GPCR 新靶点不断拓展，HTRF 技术的应用场景将进一步拓宽，未来有望助力更多治疗高血压、糖尿病、肥胖等疾病的 GPCR 新药研发，为临床治疗提供更多有效选择。
参考文献：
[1] Hauser AS, Attwood MM, Rask-Andersen M, Schiöth HB, Gloriam DE. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nat Rev Drug Discov. 2017 Dec;16(12):829-842. doi: 10.1038/nrd.2017.178. Epub 2017 Oct 27. PMID: 29075003; PMCID: PMC6882681.
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